Javascript je trenutno onemogočen v vašem brskalniku.Ko je javascript onemogočen, nekatere funkcije tega spletnega mesta ne bodo delovale.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonija, Španija * Ti avtorji imajo nekaj vpogledov v to delo Equal ozadje prispevka: Hialuronska kislina (HA) je naravni polisaharid, ki se uporablja pri izdelavi dermalnih polnil za estetske namene.Ker ima v človeških tkivih razpolovno dobo več dni, so dermalna polnila na osnovi HA kemično spremenjena, da podaljšajo njihovo življenjsko dobo v telesu.Najpogostejša modifikacija komercialnih polnil na osnovi HA je uporaba 1,4-butandiol diglicidil etra (BDDE) kot zamreževalnega sredstva za zamreženje verig HA.Ostanki ali neizreagirani BDDE veljajo za nestrupene pri < 2 delih na milijon (ppm);zato je treba kvantificirati ostanek BDDE v končnem dermalnem polnilu, da se zagotovi varnost pacientov.Materiali in metode: Ta študija opisuje odkrivanje in karakterizacijo stranskega produkta reakcije navzkrižnega povezovanja med BDDE in HA v alkalnih pogojih s kombinacijo tekočinske kromatografije in masne spektrometrije (LC-MS).Rezultati: Po različnih analizah je bilo ugotovljeno, da so alkalni pogoji in visoka temperatura, uporabljeni za dezinfekcijo hidrogela HA-BDDE, spodbudili nastanek tega novega stranskega produkta, "propilen glikolu podobne" spojine.Analiza LC-MS je potrdila, da ima stranski produkt enako monoizotopsko maso kot BDDE, drugačen retencijski čas (tR) in drugačno UV absorbanco (λ=200 nm).Za razliko od BDDE je bilo pri analizi LC-MS ugotovljeno, da ima ta stranski produkt pri enakih merilnih pogojih višjo stopnjo detekcije pri 200 nm.Zaključek: Ti rezultati kažejo, da v strukturi te nove spojine ni epoksida.Razprava je odprta za oceno tveganja tega novega stranskega proizvoda, ki ga najdemo pri proizvodnji hidrogela HA-BDDE (dermalno polnilo HA) za komercialne namene.Ključne besede: hialuronska kislina, HA dermalno polnilo, zamrežena hialuronska kislina, BDDE, LC-MS analiza, stranski produkt BDDE.
Polnila na osnovi hialuronske kisline (HA) so najpogostejša in priljubljena dermalna polnila, ki se uporabljajo v kozmetične namene.1 To dermalno polnilo je hidrogel, običajno sestavljen iz >95 % vode in 0,5-3 % HA, kar jim daje gelasto strukturo.2 HA je polisaharid in glavna sestavina zunajceličnega matriksa vretenčarjev.Ena izmed sestavin.Sestavljen je iz ponavljajočih se disaharidnih enot (1,4)-glukuronske kisline-β (1,3)-N-acetilglukozamina (GlcNAc), povezanih z glikozidnimi vezmi.Ta vzorec disaharidov je enak v vseh organizmih.V primerjavi z nekaterimi polnili na osnovi beljakovin (kot je kolagen) je zaradi te lastnosti HA zelo biokompatibilna molekula.Ta polnila lahko kažejo specifičnost zaporedja aminokislin, ki jo lahko prepozna pacientov imunski sistem.
Pri uporabi kot dermalno polnilo je glavna omejitev HA njena hitra menjava v tkivih zaradi prisotnosti specifične družine encimov, imenovanih hialuronidaze.Doslej je bilo opisanih več kemičnih modifikacij v strukturi HA za povečanje razpolovne dobe HA v tkivih.3 Večina teh modifikacij poskuša zmanjšati dostop hialuronidaze do polisaharidnih polimerov s premreževanjem verig HA.Zato zaradi tvorbe mostov in medmolekularnih kovalentnih vezi med strukturo HA in zamreževalnim sredstvom zamreženi hidrogel HA proizvede več produktov protiencimske razgradnje kot naravni HA.4-6
Doslej kemična sredstva za zamreženje, ki se uporabljajo za proizvodnjo zamrežene HA, vključujejo metakrilamid, 7 hidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil sulfon, 1,4-butandiol diglicidil eter (BDDE) in poli (etilen glikol) diglicidil eter.10,11 BDDE je trenutno najpogosteje uporabljeno zamreževalno sredstvo.Čeprav je bilo desetletja dokazano, da so te vrste hidrogelov varne, so uporabljena sredstva za zamreženje reaktivni reagenti, ki so lahko citotoksični in v nekaterih primerih mutageni.12 Zato mora biti njihova vsebnost ostankov v končnem hidrogelu visoka.BDDE velja za varnega, če je preostala koncentracija manjša od 2 delov na milijon (ppm).4
Obstaja več metod za odkrivanje koncentracije nizkega ostanka BDDE, stopnje zamreženja in položaja substitucije v hidrogelih HA, kot so plinska kromatografija, kromatografija z izključitvijo velikosti skupaj z masno spektrometrijo (MS), metode merjenja fluorescence z jedrsko magnetno resonanco (NMR) in Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) s sklopom diodnih nizov.13-17 Ta študija opisuje odkrivanje in karakterizacijo stranskega produkta v končnem zamreženem hidrogelu HA, proizvedenem z reakcijo BDDE in HA v alkalnih pogojih.HPLC in tekočinska kromatografija-masna spektrometrija (LC-MS analiza).Ker toksičnost tega stranskega produkta BDDE ni znana, priporočamo, da se kvantifikacija njegovih ostankov določi na podoben način kot metoda, ki se običajno izvaja za BDDE v končnem izdelku.
Dobljena natrijeva sol HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japonska) ima molekulsko maso ~1.368.000 Da (Laurentova metoda) 18 in intrinzično viskoznost 2,20 m3/kg.Za reakcijo zamreženja je bil BDDE (≥95 %) kupljen pri Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ZDA).Fosfatno pufrano fiziološko raztopino s pH 7,4 smo kupili pri Sigma-Aldrich Company.Vsa topila, acetonitril in voda, uporabljena v analizi LC-MS, so bili kupljeni iz kakovosti HPLC.Mravljinčna kislina (98 %) je kupljena kot reagentna kakovost.
Vsi poskusi so bili izvedeni na sistemu UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, ZDA) in povezani s trojnim kvadrupolnim masnim spektrometrom API 3000, opremljenim z virom ionizacije z elektrosprejem (AB SCIEX, Framingham, MA, ZDA).
Sintezo zamreženih HA hidrogelov smo začeli z dodajanjem 198 mg BDDE k 10 % (m/m) raztopini natrijevega hialuronata (NaHA) v prisotnosti 1 % alkalije (natrijev hidroksid, NaOH).Končna koncentracija BDDE v reakcijski mešanici je bila 9,9 mg/mL (0,049 mM).Nato smo reakcijsko zmes temeljito premešali in homogenizirali ter pustili delovati pri 45 °C 4 ure.19 pH reakcije vzdržujemo pri ~12.
Nato smo reakcijsko zmes sprali z vodo in končni hidrogel HA-BDDE filtrirali in razredčili s pufrom PBS, da smo dosegli koncentracijo HA od 10 do 25 mg/mL in končni pH 7,4.Za sterilizacijo proizvedenih premreženih hidrogelov HA so vsi ti hidrogeli avtoklavirani (120 °C 20 minut).Očiščen hidrogel BDDE-HA se do analize shrani pri 4 °C.
Za analizo BDDE, prisotnega v zamreženem proizvodu HA, stehtamo 240 mg vzorec in ga vnesemo v središčno luknjo (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, ZDA; prostornina 0,5 ml) in centrifugiramo pri 10.000 obratih na minuto pri sobni temperaturi. 10 minut.Skupno je bilo zbranih in analiziranih 20 µL tekočine za iztekanje.
Za analizo standarda BDDE (Sigma-Aldrich Co) v alkalnih pogojih (1 %, 0,1 % in 0,01 % NaOH), če so izpolnjeni naslednji pogoji, je vzorec tekočine 1:10, 1:100 ali do 1:1.000.000 Po potrebi za analizo uporabite deionizirano vodo MilliQ.
Za začetne materiale, uporabljene v reakciji navzkrižnega povezovanja (HA 2 %, H2O, 1 % NaOH in 0,049 mM BDDE), smo analizirali 1 mL vsakega vzorca, pripravljenega iz teh materialov, z enakimi pogoji analize.
Za določitev specifičnosti vrhov, ki se pojavljajo na ionski karti, smo 20 µL vzorcu dodali 10 µL standardne raztopine BDDE s 100 ppb (Sigma-Aldrich Co).V tem primeru je končna koncentracija standarda v vsakem vzorcu 37 ppb.
Najprej pripravite osnovno raztopino BDDE s koncentracijo 11.000 mg/L (11.000 ppm) tako, da razredčite 10 μL standardnega BDDE (Sigma-Aldrich Co) z 990 μL vode MilliQ (gostota 1,1 g/mL).Uporabite to raztopino za pripravo 110 µg/L (110 ppb) raztopine BDDE kot vmesne standardne razredčitve.Nato uporabite vmesno standardno razredčilo BDDE (110 ppb), da pripravite standardno krivuljo tako, da vmesno razredčilo večkrat razredčite, da dosežete želeno koncentracijo 75, 50, 25, 10 in 1 ppb.Kot je prikazano na sliki 1, je ugotovljeno, da ima standardna krivulja BDDE od 1,1 do 110 ppb dobro linearnost (R2>0,99).Standardno krivuljo smo ponovili v štirih neodvisnih poskusih.
Slika 1 Standardna umeritvena krivulja BDDE, pridobljena z analizo LC-MS, pri kateri je opažena dobra korelacija (R2>0,99).
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija.
Za identifikacijo in kvantifikacijo standardov BDDE, prisotnih v zamreženi HA, in standardov BDDE v osnovni raztopini je bila uporabljena analiza LC-MS.
Kromatografsko ločitev smo dosegli na LUNA 2,5 µm C18(2)-HST koloni (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, ZDA) in jo med analizo hranili pri sobni temperaturi (25°C).Mobilna faza je sestavljena iz acetonitrila (topilo A) in vode (topilo B), ki vsebuje 0,1 % mravljinčne kisline.Mobilna faza se eluira z gradientno elucijo.Gradient je naslednji: 0 minut, 2 % A;1 minuta, 2 % A;6 minut, 98 % A;7 minut, 98 % A;7,1 minute, 2 % A;10 minut, 2 % A. Čas delovanja je 10 minut in volumen injekcije je 20 µL.Retencijski čas BDDE je približno 3,48 minute (v razponu od 3,43 do 4,14 minute na podlagi poskusov).Mobilno fazo smo črpali s hitrostjo pretoka 0,25 ml/min za analizo LC-MS.
Za analizo BDDE in kvantifikacijo z MS je sistem UPLC (Waters) kombiniran s trojnim kvadrupolnim masnim spektrometrom API 3000 (AB SCIEX), opremljenim z ionizacijskim virom z elektrosprejem, analiza pa se izvede v načinu pozitivnih ionov (ESI+).
Glede na analizo ionskih fragmentov, opravljeno na BDDE, je bil fragment z največjo intenzivnostjo določen kot fragment, ki ustreza 129,1 Da (slika 6).Zato je v načinu večionskega spremljanja (MIM) za kvantifikacijo pretvorba mase (razmerje med maso in nabojem [m/z]) BDDE 203,3/129,1 Da.Za analizo LC-MS uporablja tudi način polnega skeniranja (FS) in način skeniranja produktnih ionov (PIS).
Da bi preverili specifičnost metode, smo analizirali slepi vzorec (začetno mobilno fazo).V slepem vzorcu s pretvorbo mase 203,3/129,1 Da ni bil zaznan noben signal.Kar zadeva ponovljivost poskusa, je bilo analiziranih 10 standardnih injekcij 55 ppb (na sredini umeritvene krivulje), kar je povzročilo preostali standardni odklon (RSD) <5 % (podatki niso prikazani).
Vsebnost preostalega BDDE je bila kvantificirana v osmih različnih avtoklaviranih BDDE zamreženih hidrogelih HA, kar ustreza štirim neodvisnim poskusom.Kot je opisano v razdelku »Materiali in metode«, je kvantifikacija ovrednotena s povprečno vrednostjo regresijske krivulje standardne razredčitve BDDE, ki ustreza edinstvenemu vrhu, zaznanemu pri masnem prehodu BDDE 203,3/129,1 Da, z retenzijo čas od 3,43 do 4,14 minute Brez čakanja.Slika 2 prikazuje primer kromatograma referenčnega standarda 10 ppb BDDE.Tabela 1 povzema vsebnost preostalega BDDE v osmih različnih hidrogelih.Razpon vrednosti je od 1 do 2,46 ppb.Zato je koncentracija preostalega BDDE v vzorcu sprejemljiva za uporabo pri ljudeh (<2 ppm).
Slika 2 Ionski kromatogram 10 ppb BDDE referenčnega standarda (Sigma-Aldrich Co), prehod MS (m/z), dobljen z analizo LC-MS 203,30/129,10 Da (v pozitivnem načinu MRM).
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij;MS, masa;m/z, razmerje med maso in nabojem.
Opomba: Vzorci 1-8 so avtoklavirani BDDE premreženi HA hidrogeli.Navedena sta tudi preostala količina BDDE v hidrogelu in vrh zadrževalnega časa BDDE.Na koncu poročajo tudi o obstoju novih vrhov z različnimi retencijskimi časi.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hialuronska kislina;MRM, spremljanje več reakcij;tR, retencijski čas;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;RRT, relativni retencijski čas.
Presenetljivo je analiza LC-MS ionskega kromatograma pokazala, da je na podlagi vseh analiziranih vzorcev hidrogela HA, premreženih v avtoklavu, prišlo do dodatnega vrha pri krajšem retenzijskem času od 2,73 do 3,29 minut.Na primer, slika 3 prikazuje ionski kromatogram zamreženega vzorca HA, kjer se pojavi dodatni vrh pri drugačnem retencijskem času približno 2,71 minute.Ugotovljeno je bilo, da je opazovani relativni retencijski čas (RRT) med na novo opaženim vrhom in vrhom iz BDDE 0,79 (tabela 1).Ker vemo, da je na novo opazovani vrh manj zadržan v koloni C18, uporabljeni v analizi LC-MS, lahko novi vrh ustreza bolj polarni spojini kot BDDE.
Slika 3 Ionski kromatogram zamreženega vzorca hidrogela HA, pridobljenega z LC-MS (pretvorba mase MRM 203,3/129,0 Da).
Okrajšave: HA, hialuronska kislina;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij;RRT, relativni retencijski čas;tR, retencijski čas.
Da bi izključili možnost, da bi bili opaženi novi vrhovi onesnaževalci, ki so bili prvotno prisotni v uporabljenih surovinah, so bile tudi te surovine analizirane z uporabo iste analizne metode LC-MS.Analizirane izhodne snovi vključujejo vodo, 2 % NaHA v vodi, 1 % NaOH v vodi in BDDE v enaki koncentraciji, uporabljeni v reakciji navzkrižnega povezovanja.Ionski kromatogram uporabljenega izhodnega materiala ni pokazal nobene spojine ali vrha, njegov retencijski čas pa ustreza novemu opazovanemu vrhu.To dejstvo ovrže zamisel, da lahko ne le vhodni material vsebuje kakršne koli spojine ali snovi, ki bi lahko motile postopek analize, ampak ni nobenega znaka možne navzkrižne kontaminacije z drugimi laboratorijskimi izdelki.Vrednosti koncentracije, dobljene po LC-MS analizi BDDE in novih vrhov, so prikazane v tabeli 2 (vzorci 1-4) in ionski kromatogram na sliki 4.
Opomba: Vzorci 1-4 ustrezajo surovinam, uporabljenim za proizvodnjo avtoklaviranih BDDE zamreženih hidrogelov HA.Ti vzorci niso bili avtoklavirani.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hialuronska kislina;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij.
Slika 4 ustreza LC-MS kromatogramu vzorca surovine, uporabljene v reakciji navzkrižnega povezovanja HA in BDDE.
Opomba: Vse to je izmerjeno pri enaki koncentraciji in razmerju, uporabljenem za izvedbo reakcije navzkrižnega povezovanja.Številke za surovine, analizirane s kromatogramom, ustrezajo: (1) vodi, (2) 2 % vodni raztopini HA, (3) 1 % vodni raztopini NaOH.Analiza LC-MS se izvede za pretvorbo mase 203,30/129,10 Da (v pozitivnem načinu MRM).
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, hialuronska kislina;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij.
Proučevali so pogoje, ki so vodili do nastanka novih vrhov.Da bi preučili, kako reakcijski pogoji, uporabljeni za proizvodnjo zamreženega HA hidrogela, vplivajo na reaktivnost zamreževalnega sredstva BDDE, kar vodi v nastanek novih vrhov (možnih stranskih produktov), so bile izvedene različne meritve.Pri teh določitvah smo proučevali in analizirali končni zamreževalec BDDE, ki smo ga obdelali z različnimi koncentracijami NaOH (0 %, 1 %, 0,1 % in 0,01 %) v vodnem mediju, čemur je sledilo avtoklaviranje ali brez njega.Bakterijski postopek za simulacijo istih pogojev je enak metodi, ki se uporablja za izdelavo zamreženega hidrogela HA.Kot je opisano v razdelku »Materiali in metode«, je bil masni prehod vzorca analiziran z LC-MS na 203,30/129,10 Da.Izračunata se BDDE in koncentracija novega vrha, rezultati pa so prikazani v tabeli 3. V vzorcih, ki niso bili avtoklavirani, niso bili odkriti novi vrhovi, ne glede na prisotnost NaOH v raztopini (vzorci 1-4, tabela 3).Pri avtoklaviranih vzorcih se novi vrhovi zaznajo samo v prisotnosti NaOH v raztopini in zdi se, da je nastanek vrha odvisen od koncentracije NaOH v raztopini (vzorci 5-8, tabela 3) (RRT = 0,79).Slika 5 prikazuje primer ionskega kromatograma, ki prikazuje dva avtoklavirana vzorca v prisotnosti ali odsotnosti NAOH.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij.
Opomba: Zgornji kromatogram: vzorec smo obdelali z 0,1 % vodno raztopino NaOH in avtoklavirali (120 °C 20 minut).Spodnji kromatogram: Vzorca nismo obdelali z NaOH, ampak avtoklavirali pod enakimi pogoji.Pretvorbo mase 203,30/129,10 Da (v pozitivnem načinu MRM) smo analizirali z LC-MS.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij.
V vseh avtoklaviranih vzorcih, z ali brez NaOH, se je koncentracija BDDE močno zmanjšala (do 16,6-krat) (vzorci 5-8, tabela 2).Zmanjšanje koncentracije BDDE je lahko posledica dejstva, da lahko pri visokih temperaturah voda deluje kot baza (nukleofil), da odpre epoksidni obroč BDDE in tvori 1,2-diolno spojino.Monoizotopska kakovost te spojine je drugačna od kakovosti BDDE in zato ne bo prizadeta.LC-MS je zaznal premik mase 203,30/129,10 Da.
Končno, ti poskusi kažejo, da je nastajanje novih vrhov odvisno od prisotnosti BDDE, NAOH in postopka avtoklaviranja, vendar nima nobene zveze z HA.
Nov vrh, ugotovljen pri retenzijskem času približno 2,71 minut, je bil nato karakteriziran z LC-MS.V ta namen smo BDDE (9,9 mg/mL) inkubirali v 1 % vodni raztopini NaOH in avtoklavirali.V tabeli 4 so značilnosti novega vrha primerjane z znanim referenčnim vrhom BDDE (retenzijski čas približno 3,47 minute).Na podlagi analize ionske fragmentacije obeh vrhov lahko sklepamo, da vrh z retencijskim časom 2,72 minute prikazuje enake fragmente kot vrh BDDE, vendar z različno intenzivnostjo (slika 6).Za vrh, ki ustreza retenzijskemu času (PIS) 2,72 minute, so opazili intenzivnejši vrh po fragmentaciji pri masi 147 Da.Pri koncentraciji BDDE (9,9 mg/mL), uporabljeni pri tem določanju, so bili po kromatografski ločitvi opaženi tudi različni načini absorbance (UV, λ=200 nm) v ultravijoličnem spektru (slika 7).Vrh z retenzijskim časom 2,71 minute je še vedno viden pri 200 nm, medtem ko vrha BDDE v kromatogramu pod enakimi pogoji ni mogoče opaziti.
Preglednica 4 Rezultati karakterizacije novega vrha z retenzijskim časom približno 2,71 minute in vrha BDDE z retenzijskim časom 3,47 minute
Opomba: Za pridobitev teh rezultatov sta bili na obeh vrhovih izvedeni analizi LC-MS in HPLC (MRM in PIS).Za analizo HPLC se uporablja UV detekcija z valovno dolžino 200 nm.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HPLC, tekočinska kromatografija visoke ločljivosti;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij;m/z, razmerje med maso in nabojem;PIS, ionsko skeniranje izdelka;ultravijolična svetloba, ultravijolična svetloba.
Opomba: Masni fragmenti so pridobljeni z analizo LC-MS (PIS).Zgornji kromatogram: masni spekter fragmentov standardnega vzorca BDDE.Spodnji kromatogram: masni spekter novega zaznanega vrha (RRT, povezan z vrhom BDDE, je 0,79).BDDE smo obdelali v 1% raztopini NaOH in avtoklavirali.
Okrajšave: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, tekočinska kromatografija in masna spektrometrija;MRM, spremljanje več reakcij;PIS, ionsko skeniranje produkta;RRT, relativni retencijski čas.
Slika 7 Ionski kromatogram prekurzorskega iona 203,30 Da in (A) novi vrh z retenzijskim časom 2,71 minut ter (B) UV-zaznava vrha referenčnega standarda BDDE pri 3,46 minutah pri 200 nm.
Pri vseh proizvedenih premreženih hidrogelih HA je bilo ugotovljeno, da je bila koncentracija preostalega BDDE po kvantifikaciji LC-MS <2 ppm, vendar se je v analizi pojavil nov neznan vrh.Ta novi vrh se ne ujema s standardnim izdelkom BDDE.Standardni izdelek BDDE je bil prav tako podvržen analizi enake pretvorbe kakovosti (pretvorba MRM 203,30/129,10 Da) v pozitivnem načinu MRM.Na splošno se druge analitske metode, kot je kromatografija, uporabljajo kot mejni testi za odkrivanje BDDE v hidrogelih, vendar je največja meja zaznave (LOD) nekoliko nižja od 2 ppm.Po drugi strani sta se doslej NMR in MS uporabljala za karakterizacijo stopnje zamreženosti in/ali modifikacije HA v fragmentih enot sladkorja zamreženih produktov HA.Namen teh tehnik nikoli ni bil kvantificirati zaznavanje ostankov BDDE pri tako nizkih koncentracijah, kot jih opisujemo v tem članku (LOD naše metode LC-MS = 10 ppb).
Čas objave: Sep-01-2021